PCRとは(基本情報)

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PCRとは、正式には「ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction)」といい、生物の遺伝情報をもつDNAを複製して増幅させる方法のことを言います。

PCRを利用すれば、ごく微量な検体/サンプル(血液、組織、細菌、ウイルス等)であっても、そこに含まれるわずかなDNAから、特定の配列だけを短時間で増やすことで目的の微生物や遺伝子配列が存在しているかを知ることができます。このPCRの特性を活かして、体内や食品などに潜む細菌やウイルスを検出し、遺伝子の研究や、DNA鑑定など幅広い分野で利用されています。

 

PCR検査 - PCRとは
PCR検査とは
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PCR法の原理

DNAとは
 

DNAは、正確にはデオキシリボ核酸(deoxyribonucleic acid)といい、デオキシリボースという糖と、リン酸、そして塩基という三つの成分で構成される非常に長い鎖のような高分子です。さらにDNAに使われる塩基にはアデニン(A)チミン(T)シトシン(C)グアニン(G)という4種類があり、このA-T-C-Gの並び方で遺伝子が決定されます。DNAは通常二本鎖が一組となる、らせん階段のような構造をしています。

この2本の鎖は、熱を加えると離れて一本鎖になり、冷やすと二本鎖として元の配列同士が結合する特性があります。PCRはこのDNAの特性を利用しています。

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PCR反応に必要なもの

・DNA(増やしたいDNA配列を含む検体から核酸抽出・精製を行っておきます)

・増やしたい配列のプライマー

・DNAポリメラーゼ

上記に加えて、dNTP(デオキシヌクレオシド三リン酸、ATGCの基質)などを含む反応液

PCR検査とは PCR検査とは


プライマーとは、増やしたい配列の両端に結合するように作られた合成DNAです。ForwardプライマーとReverseプライマーといって、二本鎖DNAのそれぞれの鎖の片側にのみ設計します。

 

DNAには方向性があり、DNAポリメラーゼは5’→3'の方向にしかDNAを合成しません。二本のDNA鎖はそれぞれ逆向き且つ相補的に結合していますのでそれぞれのDNA鎖の上流にプライマーを設計することで合成したいDNAの範囲を決めることができるのです。DNAポリメラーゼとはDNAを複製させるための酵素です。PCRに用いられるDNAポリメラーゼは激しい温度の上下に耐えられる、耐熱性DNAポリメラーゼといわれるような特殊な酵素です。もともとはイエローストーン国立公園の熱泉に棲む好熱菌Thermus aquaticusが産生するDNAポリメラーゼが使われました。

 

PCR検査とは


 

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ステップ1(熱変性(denaturation))

DNAに熱を加える(通常95℃程度)と、2本の鎖が分離し、1本ずつの鎖になります。

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ステップ 2(アニーリング(annealing))

次に徐々に温度を下げていきます(通常55℃~65℃、プライマーの長さや配列による)。これにより、ステップ1で一本鎖にしたDNA鎖のターゲット部分にあらかじめ反応液の中に入れておいたプライマーが結合します。一般的に、プライマーは15~30塩基の長さからなる一本鎖の短い合成DNA断片です。元の長い鎖同士も再結合しようと試みますが、プライマーの方が短く、圧倒的に量が多いので、元のDNA同士が結合するよりも早く反応が進みます。

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アニーリングとは

日本語で”焼なまし”を意味する単語です。適切な温度に加熱及び灼熱した後、室温に戻ったときに、平衡に近い組織状態になるような条件で冷却することからなる熱処理のことをいいます。

 

ステップ 3(伸長(extension))

再び、温度を上げます(72℃位)。DNAポリメラーゼが作用して新たなDNA分子が合成されます。プライマーを起点として、下流方向に向けてそれぞれの鎖を鋳型に、対となる鎖が作成されるのです。

 

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ステップ1~3の”サイクル”によって一組の二本鎖DNAから二組の二本鎖DNAができる計算になります。したがって、このサイクルを繰り返すことで、DNAを2倍、4倍、8倍と、増幅させることができます。

 

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